摘要

實(shí)體瘤中的缺氧仍然是傳統(tǒng)癌癥療法面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。作為抗藥性、轉(zhuǎn)移發(fā)展和藥物生物加工的來(lái)源，它影響著治療效果和疾病預(yù)后。生物還原性鉑(IV)原藥可能比傳統(tǒng)的金屬療法更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵谶€原性環(huán)境(如缺氧環(huán)境)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是藥物活化的必要條件。本研究分兩步篩選了具有不同還原率和親脂性的實(shí)驗(yàn)性鉑(IV)原藥，目的是找出最合適的化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。第一步，利用一組對(duì)鉑(II)化合物具有不同敏感性的癌細(xì)胞系，在缺氧多細(xì)胞球和單層培養(yǎng)中比較所有化合物的細(xì)胞毒性。其次，在SCID小鼠模型的缺氧異種移植物中測(cè)試了兩種所選化合物與沙鉑的比較，此外，還對(duì)這些化合物在缺氧球體和異種移植物中進(jìn)行了基于(LA)-ICP-MS的積累和分布研究。我們的研究結(jié)果表明，雖然細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性與親脂性密切相關(guān)，但與非缺氧條件相比，鉑(IV)原藥在缺氧條件下的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性取決于它們的還原率。

引言

順鉑自20世紀(jì)70年代末被批準(zhǔn)用于癌癥治療以來(lái)，一直被廣泛使用，因此常被稱(chēng)為"癌癥青霉素"。這種化療藥物的持續(xù)成功激發(fā)了用于抗癌治療的鉑(II)化合物的進(jìn)一步發(fā)展，產(chǎn)生了數(shù)百種順鉑類(lèi)似物。除順鉑外，奧沙利鉑和卡鉑是唯一廣泛應(yīng)用于臨床的金屬基抗癌藥物，而其他藥物，如皮鉑，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。然而，鉑療法的主要局限性依然存在，如耐藥性的產(chǎn)生和劑量限制性副作用。為了克服順鉑治療的弊端，人們嘗試探索鉑(IV)化合物。以鉑(IV)為基礎(chǔ)的原藥中最突出的代表—沙鉑，作為不同癌癥類(lèi)型的單一療法和聯(lián)合療法，正在進(jìn)行不同的I、II和III期臨床試驗(yàn)，但與標(biāo)準(zhǔn)療法相比，大多數(shù)試驗(yàn)都顯示出中等或較低的活性。然而，鉑(IV)復(fù)合物是很有前途的抗癌藥物，因?yàn)樗鼈兙哂懈叻€(wěn)定性和生物利用度，可以口服應(yīng)用并克服腎毒性等副作用。鉑(IV)絡(luò)合物必須通過(guò)還原激活才能釋放出其活性鉑(II)代謝物。因此，鉑(IV)復(fù)合物作為生物還原性原藥，可用于治療缺氧，縮小傳統(tǒng)金屬療法和靶向療法之間的差距。

缺氧是進(jìn)展期實(shí)體瘤的一個(gè)重要特征，幾十年來(lái)一直是傳統(tǒng)抗癌療法面臨的挑戰(zhàn)。由于包括鉑(II)類(lèi)藥物在內(nèi)的大多數(shù)化療藥物都以高度增殖的癌細(xì)胞為目標(biāo)，通常與缺氧相關(guān)的強(qiáng)大靜止細(xì)胞部分幾乎不受許多治療方法的影響。此外，壞死和缺氧區(qū)域會(huì)在腫瘤組織中產(chǎn)生不均勻性，其物理化學(xué)和生物學(xué)特性也會(huì)發(fā)生變化，如pH和pO2梯度以及不同的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。這種生物還原環(huán)境會(huì)影響化療藥物的穩(wěn)定性，并導(dǎo)致這些藥物發(fā)生特定的生物轉(zhuǎn)化。在這種情況下，鉑(IV)復(fù)合物可能比其他治療方法更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)殂K(IV)復(fù)合物必須先還原才能激活藥物。然而，迄今為止，有關(guān)鉑(IV)在缺氧腫瘤中的活化情況的研究還很少。

Hall等人和Mellor等人認(rèn)為，鉑(IV)絡(luò)合物在實(shí)體瘤條件下可能被還原成具有活性的鉑(II)對(duì)應(yīng)物。不同的小分子量還原劑，如抗壞血酸、谷胱甘肽或氨基酸，如L-蛋氨酸和L-半胱氨酸，以及蛋白質(zhì)，如金屬硫蛋白和白蛋白，都被認(rèn)為是體內(nèi)和體外細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外還原的原因。然而，鉑(IV)還原的確切機(jī)制仍不清楚，試圖研究腫瘤微環(huán)境對(duì)鉑(IV)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響也沒(méi)有完全得出結(jié)論。盡管如此，鉑(IV)化合物在實(shí)體瘤缺氧條件下可能被還原的假說(shuō)仍在討論之中，而這一假說(shuō)的證實(shí)還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究特別考察了缺氧對(duì)三種在研鉑(IV)化合物、其主要鉑(II)代謝物以及作為參考化合物的沙鉑在不同人體和體外人類(lèi)癌癥模型中活性的影響(圖1)。

圖1、正在研究的鉑(IV)復(fù)合物1-3的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括作為主要鉑(II)代謝物4和參考化合物satraplatin。

所研究的鉑(IV)配合物具有相同的赤道配體球，而它們的軸配體則不同，1、2和3的配體分別為反式二羥基、反式二羥基乙酰基和反式二乙酰基。配體球的變化與抗壞血酸和谷胱甘肽存在時(shí)的還原率、還原電位和親脂性不同有關(guān)，而可能的鉑(II)代謝物和穩(wěn)定性則相當(dāng)。這一系列理化性質(zhì)使這些化合物非常適合作為模型配合物，用于研究在缺氧條件下還原速率對(duì)鉑(IV)藥物抗增殖活性的影響。

首先，在單層和缺氧多細(xì)胞球狀模型中測(cè)試了研究用復(fù)合物1-3，以了解其細(xì)胞毒性效力對(duì)所用細(xì)胞培養(yǎng)條件的依賴(lài)性。隨后，化合物1和2(相對(duì)于單層培養(yǎng)物而言，在缺氧球形體中表現(xiàn)最佳)在非缺氧球形體模型、缺氧單層模型和雄性SCID小鼠模型中進(jìn)行了進(jìn)一步測(cè)試。此外，鉑在球體內(nèi)的分布和細(xì)胞積累研究進(jìn)一步揭示了化合物的行為及其作用模式。

材料與方法

細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

人類(lèi)細(xì)胞系CH1(通過(guò)STR圖譜鑒定為Multiplexion的PA-1卵巢畸胎癌細(xì)胞)和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116(ATCCs CCL-247t)在MEM(補(bǔ)充10%熱滅活胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸溶液)中生長(zhǎng)。人HT1080(ATCCs CCL-121t)纖維肉瘤細(xì)胞和CCD-18Co正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞保存在添加10%FCS的MEM(Sigma)中。所有細(xì)胞系的單層培養(yǎng)物均生長(zhǎng)在經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的75cm2燒瓶中。

球形體培養(yǎng)

對(duì)于球形細(xì)胞的生產(chǎn)，CH1/PA-1、HCT116和HT1080細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶化從培養(yǎng)瓶中收獲，并在MEM中播種，使用未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的圓底96孔板(VWR)，對(duì)于處理前7天直徑大于400微米的球形細(xì)胞，其密度分別為每孔1×104個(gè)(CH1/PA-1)、2×103個(gè)(HCT116)和8×103個(gè)(HT1080)；對(duì)于處理前3天直徑小于200微米的球形細(xì)胞，其密度分別為每孔1×103個(gè)(CH1/PA-1)、0.3×103個(gè)(HCT116)和0.3×103個(gè)(HT1080)。3×103(HCT116)、0.3×103(HT1080)個(gè)有活力細(xì)胞。為盡量減少蒸發(fā)，最外層的孔不用于球形細(xì)胞的培養(yǎng)，而是注入200mL的PBS。培養(yǎng)物在37攝氏度、含95%空氣和5%CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)。